Jaki jest wpływ proszku IPTG na ekspresję białek w różnych składach pożywek?

Na początek porozmawiajmy o tym, czym jest proszek IPTG. IPTG, czyli izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd, jest dobrze znanym induktorem w biologii molekularnej. Służy do włączania ekspresji genów znajdujących się pod kontrolą operonu lac. Kiedy dodasz IPTG do swojej hodowli, naśladuje ona działanie allolaktozy, naturalnego induktora, i wiąże się z represorem lac. To wiązanie powoduje zmianę konformacyjną w represorze, uniemożliwiając mu wiązanie się z regionem operatorowym DNA. W rezultacie polimeraza RNA może swobodnie transkrybować geny znajdujące się poniżej operatora, co prowadzi do ekspresji białka.

Podłoże LB (Luria – Bertani) jest jednym z najczęściej stosowanych podłoży w mikrobiologii. Jest bogaty w składniki odżywcze i zapewnia doskonałe środowisko do rozwoju bakterii. Stosując IPTG w pożywce LB, zwykle uzyskuje się całkiem dobrą indukcję ekspresji białka. Bakterie mają mnóstwo zasobów do wzrostu i syntezy białek, gdy IPTG uruchomi ekspresję genu.

Istnieją jednak pewne wady. Czasami bakterie mogą rosnąć zbyt szybko w pożywce LB, a kultura o dużej gęstości może prowadzić do problemów, takich jak ograniczenie tlenu i gromadzenie się toksycznych produktów ubocznych. Może to mieć wpływ na jakość i ilość wyrażanego białka. Ponadto bogate składniki odżywcze zawarte w LB mogą czasami powodować, że bakterie oprócz białka docelowego produkują wiele innych białek, co utrudnia proces oczyszczania.

Pożywka minimalna M9 jest bardziej zdefiniowaną pożywką w porównaniu z LB. Zawiera wyłącznie składniki odżywcze niezbędne do wzrostu bakterii, takie jak sole, źródło węgla (zwykle glukoza) i źródło azotu. Gdy stosuje się IPTG w pożywce minimalnej M9, ekspresję białka można ściślej regulować.

Ponieważ bakterie mają mniej zasobów w M9, rosną wolniej. To wolniejsze tempo wzrostu może być korzystne w przypadku niektórych białek, zwłaszcza tych, które są trudne do ekspresji lub są podatne na nieprawidłowe fałdowanie. Bakterie mają więcej czasu na prawidłowe zwinięcie białek, co skutkuje wyższą wydajnością prawidłowo sfałdowanych i funkcjonalnych białek. Jednakże, ponieważ wzrost jest wolniejszy, osiągnięcie optymalnej gęstości komórek do indukcji może zająć więcej czasu, a ogólny uzysk białka może być niższy w porównaniu z pożywką LB.

Media autoindukcyjne są stosunkowo nowym osiągnięciem w tej dziedzinie. Podłoża te zaprojektowano tak, aby automatycznie indukowały ekspresję białka w odpowiednim momencie cyklu wzrostu bakterii. Zawierają mieszaninę źródeł węgla, takich jak glukoza i laktoza.

Na początku fazy wzrostu bakterie zużywają glukozę, która tłumi operon lac. Gdy poziom glukozy się wyczerpie, bakterie zaczynają wykorzystywać laktozę. Laktoza może działać jako naturalny induktor, podobnie jak IPTG. Ponadto nadal można dodać niewielką ilość IPTG, aby zwiększyć indukcję.

Zaletą stosowania IPTG w mediach autoindukcyjnych jest uproszczenie procesu indukcji. Nie musisz monitorować gęstości komórek i dodawać IPTG w odpowiednim momencie. Ponadto pożywki autoindukcyjne mogą czasami prowadzić do wyższej wydajności białka i lepszej jakości białka w porównaniu z pożywkami tradycyjnymi.