DPL{0}}(połączyć:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) to hormon polipeptydowy składający się z 30 aminokwasów. Dzięki dogłębnym badaniom GLP{2}} opracowano coraz więcej metod syntetycznych. Ten artykuł będzie systematycznie przedstawiał znane obecnie metody syntezy GLP{3}}.
Metoda 1, synteza na fazie stałej:
Synteza w fazie stałej jest szeroko stosowaną metodą syntezy peptydów i białek, a także jest powszechnie stosowana do syntezy GLP-1. W syntezie w fazie stałej struktura rdzenia jest tworzona przez połączenie pierwszego aminokwasu z żywicą. Następnie dodaje się kolejno kolejny aminokwas i poddaje reakcji chemicznej z odpowiednim środkiem kondensującym. Na koniec docelowy produkt można otrzymać przez odszczepienie polipeptydu od żywicy.
Znaczenie syntezy w fazie stałej polega na tym, że umożliwia ona automatyzację i produkcję syntezy peptydów na dużą skalę. Obecne główne metody syntezy na fazie stałej obejmują Fmoc i Boc. Wśród nich metoda Fmoc wykorzystuje grupę zabezpieczającą N-Fmoc do ochrony peptydu, podczas gdy metoda Boc wykorzystuje tert-butyloksykarbonyl do ochrony grupy karboksylowej.
Metoda druga, synteza w fazie ciekłej:
Synteza w fazie ciekłej to tradycyjna metoda syntezy peptydów, w której reagenty są umieszczane w fazie ciekłej w celu przeprowadzenia reakcji. Zaletą syntezy w fazie ciekłej jest to, że warunki reakcji są łagodne i odpowiednie do modyfikacji wrażliwych struktur chemicznych. Jednak ze względu na zbyt dużą liczbę reagentów proces oczyszczania jest stosunkowo uciążliwy. Reakcje chemiczne w syntezie w fazie ciekłej obejmują:
1. Reakcja kondensacji:
Reakcja kondensacji jest jedną z najbardziej podstawowych reakcji w syntezie peptydów, to znaczy grupa karboksylowa inicjowana przez czynniki kondensujące, takie jak DCC i HOBt, jest łączona z grupą aminową aminokwasu poprzez reakcję acylowania. Warunki reakcji są łagodne, a wydajność wysoka.
2. Reakcje eliminacji:
Reakcja eliminacji polega na redukcji metioniny do ditiolu przez NaBH4 i inne środki redukujące, czyniąc ją nieaktywną. Reakcję należy przeprowadzić w warunkach zasadowych.
3. Usuwanie grup zabezpieczających:
Ze względu na różne funkcje aminokwasów w łańcuchu peptydowym, do ochrony zostaną użyte różne grupy zabezpieczające. Po zakończeniu syntezy należy usunąć grupę zabezpieczającą. W przypadku metody Fmoc do usunięcia Fmoc zwykle stosuje się piperydynę; podczas gdy w przypadku metody Boc TFA służy do usuwania Boc.
Metoda trzecia, synteza chemiczna:
GLP{0}} to hormon polipeptydowy o ważnych aktywnościach biologicznych. Jego syntezę można realizować różnymi metodami, wśród których jedną z najczęściej stosowanych jest synteza chemiczna. Zaletą syntezy chemicznej jest to, że może ona wytwarzać wysoce czyste produkty docelowe, które nadają się do produkcji na dużą skalę. Metoda syntezy chemicznej i szczegółowe etapy GLP{2}} zostaną przedstawione poniżej.
1. Droga syntezy i wybór grupy zabezpieczającej:
Cząsteczka GLP-1 składa się z 36 aminokwasów, w tym 21 aminokwasów typu L i 15 aminokwasów typu D. Przed przeprowadzeniem syntezy konieczne jest wybranie odpowiedniej drogi syntezy i wybranie odpowiedniej grupy zabezpieczającej zgodnie z warunkami syntezy. Synteza Fmoc w fazie stałej jest zwykle stosowana do zautomatyzowanej syntezy na dużą skalę. Ta metoda wykorzystuje ochronę N-9-fluoroimidokarboksylową (N-Fmoc) jako grupę zabezpieczającą, a także wymaga wybrania odpowiedniej drugorzędowej grupy zabezpieczającej (takiej jak tert-butyl lub metyl), aby zapewnić ochronę określonych miejsc. Za każdym razem, gdy dodawany jest nowy aminokwas, należy najpierw usunąć grupę zabezpieczającą Fmoc, a następnie dodać zabezpieczoną substancję sprzęgającą następnego aminokwasu.
2. Synteza rdzeniowej sekwencji aminokwasowej:
Sekwencja rdzeniowa GLP{0}} składa się z 21 aminokwasów, w tym kluczowej seryny i czterech sekwencji dipeptydowych kwasu proliloglutaminowego. W syntezie na fazie stałej syntezę sekwencji rdzenia można podzielić na następujące etapy:
2.1. Dodaj karbaminian kwasu octowego (Fmoc-NH-CH2CO2Et) i 2-Cl-Trt-Cl do żywicy syntetycznej w fazie stałej i przeprowadź reakcję kondensacji ze środkiem sprzęgającym DIC/NMM.
2.2. Usuń grupę zabezpieczającą Fmoc poprzez reakcję grupy odbezpieczającej.
2.3. Dodać następny aminokwas, powtarzać kolejno krok 1 i krok 2, aż do zsyntetyzowania sekwencji rdzenia.
2.4. Tworzenie struktur pentapeptydowych na żywicy w fazie stałej. Dodać odczynnik acetalizujący do żywicy w fazie stałej, zareagować z N-końcowym środkiem rozpoznającym (takim jak HBTU), dodać grupę zabezpieczającą łańcuch boczny seryny jako pomocniczy środek redukujący, a następnie usunąć grupę zabezpieczającą Fmoc.
2.5. Pod wpływem katalizy transferazy Bacillus subtilis (ProTide) struktura pentapeptydu ulega reakcji wymiany z prekursorem jodooctanu seryny.
3. Synteza pozostałej sekwencji aminokwasowej:
Po zakończeniu syntezy sekwencji rdzeniowej konieczne jest dalsze dodawanie pozostałych aminokwasów, w tym aminokwasów typu L i D. Dodawanie tych aminokwasów należy rozpocząć od sekwencji rdzeniowej, dodać kolejny aminokwas w sekwencji i użyć odpowiedniego czynnika kondensującego w celu przeprowadzenia reakcji chemicznych, aż do zsyntetyzowania kompletnej cząsteczki polipeptydu GLP-1. Podczas tego procesu konieczne jest również wybranie odpowiedniej grupy zabezpieczającej zgodnie z wymaganiami oraz przeprowadzenie kolejno etapów reakcji, usunięcia grupy zabezpieczającej i dodania aminokwasu.
4. Leczenie wodorotlenkiem sodu:
Po dodaniu wszystkich aminokwasów na żywicy w fazie stałej tworzy się niecałkowicie zsyntetyzowany łańcuch peptydowy, który musi zostać przetworzony, aby utworzyć w pełni uformowaną cząsteczkę peptydową. Po pierwsze, nieuformowany peptyd powinien zostać zhydrolizowany wodorotlenkiem sodu, tak aby C-końcowa grupa karboksylowa pierwotnie związana z żywicą została odłączona od żywicy, a grupa zabezpieczająca została odłączona w wodzie. Po reakcji hydrolizy otrzymuje się docelowy produkt.
5. Opady i przemywanie:
Po obróbce zhydrolizowany roztwór traktuje się kwasem w celu wytrącenia docelowego produktu. Następnie osad ponownie zawieszono w wodzie, po czym przeprowadzono intensywne płukanie w celu usunięcia zanieczyszczeń.
6. Oczyszczanie:
Ostatnim etapem jest oczyszczanie pożądanego produktu, zwykle przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Podczas tego procesu czystość produktu można określić wykrywając pik roztworu w widmie masowym. Krótko mówiąc, chemiczna synteza GLP{0}} wymaga wielu rund złożonych reakcji i rygorystycznych procesów oczyszczania, aby ostatecznie otrzymać aktywny produkt docelowy.
Metoda czwarta, biosynteza:
GLP{0}} jest ważnym hormonem polipeptydowym o różnych efektach fizjologicznych, w tym pobudzaniu wydzielania insuliny, tłumieniu apetytu, zmniejszaniu masy ciała i utrzymywaniu wrażliwości na insulinę itp. Metoda biosyntezy GLP-1 jest syntetyzowana głównie przez komórki L w gruczole trzustkowym, a szybkość jego syntezy jest regulowana spożyciem. Szczegółowe kroki przedstawiono w następujący sposób:
1. Prace przygotowawcze przed syntezą:
Przed biosyntezą GLP-1 należy wykonać pewne prace przygotowawcze, w tym określić typ użytych komórek, ustalić warunki hodowli i wybrać odpowiedni enzym katalityczny. Komórki L są głównym źródłem syntezy GLP-1, ponieważ zawierają prekursory dwóch hormonów, GIP (peptyd glukagonopodobny 1) i GLP-1. Komórki L można izolować z nabłonka jelitowego królików lub myszy. Przed biosyntezą należy wyhodować wystarczającą liczbę komórek, zapewnić wystarczającą ilość składników odżywczych i odpowiednie warunki hodowli. Ponadto konieczne jest wybranie odpowiedniego enzymu katalitycznego w celu promowania reakcji.
2. Synteza i przetwarzanie prekursorów:
Biosynteza GLP-1 zachodzi głównie w komórkach L, a jej prekursor składa się z dwóch hormonów, GIP i GLP-1. Po wniknięciu do komórek wydzielania wewnętrznego GIP i GLP{2}} są przetwarzane przez enzymy proteolityczne i rozszczepiane na pojedyncze peptydy. W proces ten zaangażowanych jest szereg enzymów i kofaktorów, w tym prekursorowa kwasaza polipeptydowa (PC2), izomeraza i późne czynniki adhezyjne.
3. Wzajemna konwersja między segmentami polipeptydowymi:
Po obróbce peptydy GIP i GLP-1 są rekombinowane, tworząc polipeptyd GLP-1. Proces ten wymaga użycia glukagonopodobnego peptydu 1 (GLP{4}}) jako matrycy, z którą łączy się inne pojedyncze peptydy, tworząc nowe złożone polipeptydy. Proces ten wymaga również pewnych specyficznych enzymów i czynników, w tym konwertazy prohormonu 1/3 (PC1/3) i karboksypeptydazy E (CPE).
4. Wydzielanie GLP-1:
Po zsyntetyzowaniu i przetworzeniu GLP{0}} jest on przechowywany w cytoplazmie i pęcherzykach wewnętrznych komórek wydzielania wewnętrznego. Po stymulacji dietą komórki wydzielania wewnętrznego uwalniają GLP-1 i wchodzą do krwioobiegu przez mikronaczynia. Proces ten jest regulowany i kontrolowany przez szereg szlaków transdukcji sygnału, w tym cAMP-Ca2 plusyi tak dalej.
Krótko mówiąc, biosynteza GLP{0}} obejmuje wspólne działanie wielu ogniw i czynników. Połączenie biosyntezy i syntezy chemicznej może zapewnić lepszą podstawę i wsparcie dla badań i produkcji GLP-1.
Metoda piąta, synteza enzymatyczna:
Synteza enzymatyczna to synteza łańcuchów peptydowych poprzez katalizę enzymów biologicznych. W porównaniu z tradycyjnymi metodami syntezy w fazie ciekłej, syntezę enzymatyczną można prowadzić w temperaturze pokojowej i można wybrać szeroki zakres surowców. Enzymy, takie jak syntaza płynna theta, AEP, ACE itp. są zwykle używane do katalizowania syntezy.
Podsumowując, powyższe metody są wykonalnymi metodami syntezy GLP-1. Różne metody są odpowiednie dla różnych warunków eksperymentalnych i środowisk produkcji farmaceutycznej.