Protokół IPTGto nienaturalny związek z grupą izopropylową i galaktozową. Jego wzór cząsteczkowy to C9H18O5S, o względnej masie cząsteczkowej 238,30. IPTG jest rozpuszczalny w wodzie i ma wysoką stabilność. W biologii IPTG stosuje się głównie jako induktor i może indukować - Aktywność galaktozydazy. IPTG (izopropyl) - D-tiogalaktozyd jest powszechnie stosowanym odczynnikiem laboratoryjnym, szeroko stosowanym w dziedzinach biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Jest to sztucznie syntetyzowany związek o strukturze zbliżonej do naturalnej laktozy, ale o innych właściwościach chemicznych.
(Link do produktu 1:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/api-researching-only/iptg-reagent-cas-367-93-1}.html )
(Link do produktu 1:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/api-researching-only/iptg-powder-cas-367-93-1}.html )
1. Struktura molekularna:
Wzór chemiczny IPTG to C9H18O5S, CAS 367-93-1, a względna masa cząsteczkowa wynosi 238,30 g/mol. Jego struktura jest połączona grupą izopropylową z - Pozycja C1 D-tiogalaktozydu tworzy wiązanie estrowe. Taka struktura umożliwia IPTG symulowanie efektu indukcyjnego laktozy na laktazę.
Jego struktura molekularna składa się głównie z następujących części:
Część cukrowa: Część cukrową IPTG stanowi - D-galaktoza, podobna do tiogalaktozy, jest również rozpoznawana przez galaktozydazę Escherichia coli.
Ugrupowanie tiogalaktozylowe: W przeciwieństwie do zwykłej galaktozy, ugrupowanie galaktozylowe IPTG zostaje zastąpione atomami siarki, co umożliwia chemiczną modyfikację IPTG przez E. coli. Galaktozydaza rozpoznaje i służy jako jej substrat.
Grupa izopropylowa: Drugą częścią IPTG jest grupa izopropylowa, która zmniejsza rozpuszczalność IPTG w wodzie i ułatwia jego przenikanie w hodowli komórkowej.
Pod względem budowy molekularnej substrat IPTG i galaktozydazy – D-galaktozyd (G1P) jest podobny, z tą różnicą, że do części galaktozydowej dodany jest atom siarki. Kiedy IPTG jest pobierany przez komórki, może działać jako - Substrat galaktozydazy, która pod wpływem enzymu- - D-glukozy rozszczepia grupy tiogalaktozowe i izopropylowe. Energię uwolnioną w tym procesie można wykorzystać do syntezy wyrażonych obcych białek.
Oprócz cech struktury molekularnej, IPTG ma również kilka zalet, które czynią go powszechnie stosowanym induktorem. Po pierwsze, jego rozpuszczalność w wodzie jest stosunkowo dobra i można go łatwo dodać do pożywki hodowlanej. Po drugie, jego indukujące działanie na Escherichia coli jest stosunkowo łagodne i nie powoduje zbyt dużego nacisku na komórki, co korzystnie wpływa na wydłużenie życia komórek. Ponadto wychwyt i wykorzystanie IPTG w komórkach jest stosunkowo szybkie, co może wywołać ekspresję genów w odpowiednim czasie
2. Rozpuszczalność:
IPTG jest bezbarwną, krystaliczną substancją stałą o dobrej rozpuszczalności w wodzie. Może szybko rozpuścić się w temperaturze pokojowej i utworzyć przezroczysty roztwór. Ponadto IPTG jest również rozpuszczalny w niektórych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak metanol, etanol i sulfotlenek dimetylu.
3. Stabilność:
IPTG jest stosunkowo stabilny w konwencjonalnych warunkach eksperymentalnych i nie jest podatny na rozkład ani degradację. Można go przechowywać przez długi czas bez utraty swojej aktywności. Jednakże w wysokiej temperaturze lub w warunkach kwasowych IPTG może ulegać reakcjom hydrolizy, powodując utratę zdolności do indukowania laktazy.
4. Indukowanie laktazy:
IPTG jest skutecznym induktorem laktazy. W większości Escherichia coli laktaza jest ważnym enzymem metabolicznym używanym do rozkładania laktozy na glukozę i galaktozę. IPTG ma podobną budowę do laktozy i może wiązać się z miejscem indukcji laktazy i aktywować jej transkrypcję. To sprawia, że IPTG jest ważnym narzędziem do badania regulacji ekspresji genów i ekspresji białek.
U bakterii operony laktozowe są ważnym systemem regulacyjnym, który może regulować bakteryjny metabolizm laktozy. Gdy w komórkach bakteryjnych brakuje glukozy, operony laktozowe indukowane są do syntezy enzymów zdolnych do rozkładania laktozy.
Skład operonów laktozowych: Operon laktozowy składa się z trzech genów, mianowicie lacZ, lacY i lacA. Wśród nich lacZ kodujący - galaktozydazę, lacY koduje białko przepuszczalności, lacA koduje acetylotransferazę. Te trzy geny współpracują, aby umożliwić bakteriom wykorzystanie laktozy.
Mechanizm działania IPTG: Jeśli IPTG istnieje, może wchodzić w interakcje z - Wiązanie galaktozydazy wzmaga aktywność enzymu. To wiązanie osiąga się poprzez oddziaływanie pomiędzy grupą galaktozową w cząsteczce IPTG i - Osiąga się wiązanie aktywnego centrum galaktozydazy. Wiązanie to zwiększa aktywność enzymu, ułatwiając w ten sposób rozkład laktozy.
Proces indukcji: W środowisku pozbawionym glukozy syntetyzowane są geny lacY i lacA, ale stopień syntezy jest stosunkowo niewielki. Gdy IPTG istnieje, może wchodzić w interakcje z - Wiązanie galaktozydazy zwiększa aktywność enzymu. Wiązanie to stymuluje transkrypcję genów lacY i lacA, umożliwiając bakteriom syntezę dużej liczby białek przepuszczalnych i acetylotransferaz. Enzymy te mogą promować bakteryjny metabolizm laktozy.
Czynniki wpływające: Stężenie IPTG będzie miało wpływ na efekt indukcji. Niskie stężenie IPTG może sprzyjać - Syntezie galaktozydazy, ale wysokie stężenia IPTG mogą mieć toksyczne działanie na komórki. Ponadto na efekt indukcyjny IPTG wpływają również takie czynniki, jak temperatura, wartość pH i czas hodowli.
5. Nietoksyczność:
W porównaniu z laktozą tempo metabolizmu IPTG w komórkach jest wolniejsze, więc ma mniejszy wpływ na wzrost i metabolizm komórek. To sprawia, że IPTG jest powszechnie stosowanym induktorem w laboratorium do kontrolowania ekspresji docelowych genów.
6. Zastosowanie:
IPTG stosuje się głównie w następujących aspektach:
-Ekspresja białka: Stosując induktory IPTG, można kontrolować wydajność białek docelowych w układzie ekspresji rekombinowanego białka. Można go stosować do badania procesów biologicznych, takich jak funkcja białek, interakcja i przekazywanie sygnału. Na przykład poprzez eksperymenty z krystalizacją białek można badać strukturę i funkcję białek; Poprzez eksperymenty dotyczące interakcji białek można badać interakcje między białkami; Poprzez eksperymenty z transdukcją sygnału można zbadać rolę białek w transdukcji sygnału.
-Badania nad regulacją genów: IPTG może symulować mechanizm indukcji laktozy w komórkach, badając w ten sposób sieci regulacji genów i ścieżki przekazywania sygnału. W eksperymentach z regulacją ekspresji genów IPTG służy jako induktor i może wiązać się z lac| produkty w operonach laktozowych, wywołujące zmiany konformacyjne i powodujące lac|produkty opuszczają miejsce wiązania promotora, aktywując w ten sposób transkrypcję. Ten indukowalny mechanizm regulacji transkrypcji sprawia, że IPTG odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów. Kontrolując czas dodawania i stężenie IPTG, można osiągnąć regulację ekspresji docelowego białka.
-Badania nad czynnikami transkrypcyjnymi: IPTG można wykorzystać do badania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a ich genami docelowymi, a także mechanizmów regulacji funkcjonalnej czynników transkrypcyjnych. Łącząc się z replikatorem laktazy, IPTG może symulować proces regulacji laktozy na laktazę, kontrolując w ten sposób ekspresję genów. Ten mechanizm indukcji można zastosować do badań nad czynnikami transkrypcyjnymi w celu zbadania regulacyjnej roli czynników transkrypcyjnych w transkrypcji określonych genów. Na przykład, można skonstruować wektor ekspresyjny zawierający docelowy czynnik transkrypcyjny i zintegrować go z odpowiednimi promotorami i elementami regulatorowymi z wektorem ekspresyjnym, po czym dodać IPTG w celu indukowania ekspresji docelowego czynnika transkrypcyjnego.
IPTG jest powszechnie stosowanym odczynnikiem laboratoryjnym o dobrej rozpuszczalności i stabilności. Może indukować ekspresję laktazy i jest szeroko stosowany w biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Wykorzystując IPTG, badacze mogą badać ważne kwestie biologiczne, takie jak mechanizmy regulacji genów, ekspresja białek i funkcja czynników transkrypcyjnych.